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標題: 如何解決峰拖尾與峰前延？ [打印本頁]

作者: 慧慧蘋果醬 時間: 2023-4-7 11:38
標題: 如何解決峰拖尾與峰前延？
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峰形對稱性的優(yōu)劣對峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結果的準確性。色譜實踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設定、色譜條件和方法正確與否對峰形有很大影響。
引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個特點：對先出的峰影響大，對后出峰影響??；柱頭塌陷、柱頭和篩板污染會引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會造成峰拖尾。

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峰拖尾常見的3種拖尾情況：

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次級保留引起峰拖尾的機理解析：

反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級保留效應。

反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5～4.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動相的pH-pKa>2即pH>6.7時，99%以上的硅羥基應該是呈離子狀態(tài)的，即Si-O- ，而pKa-pH>2即pH<2.5時，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99%以上的硅羥基應該是呈分子狀態(tài)的，即Si-OH，但其極性依舊存在，即Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強得多。同時，因為硅膠表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關系。

完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應的僅達2～3.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個惰性基團。三甲基硅烷還是比氫原子大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。

相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機會，獲得良好的峰形。

解決方案：
1)先檢查樣品是否過載

由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進樣量(包括進樣體積或濃度)，進樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測定：

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2)調節(jié)流動相pH
將流動相的pH調至比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定：

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堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH< 8.64的時候它是完全呈離子態(tài)的，那么pH在2.5~8.64時，特別是pH6.7～8.64時，此時甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)-NH3+和Si-O-形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林(含-N(CH3)2，堿性比-NH2強)在pH 7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱之間的優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH<2.5的條件下，也依舊后拖，是因為-NH3+足夠強，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與Si-Oδ-Hδ+中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導致峰形拖尾。當pH>12.64，大于pKa2以上時，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會引起拖尾。

3)增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度
流動相中加入緩沖鹽，增強了流動相的離子強度，在-NH3+等極性基團和硅羥基Si-O-之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機會，有助于削弱極性基團與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱(如氨基的N原子與強吸電子基相連)，或堿性很強，但在剛性結構中，比較難以接近被C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測定：

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4)加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等
拖尾的產(chǎn)生是因為-NH2、-NHR、-NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應該有兩種，一種是占據(jù)硅羥基這個作用位點，另一種是占據(jù)-NH2、-NHR、-NR2這個作用位點。

在流動相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH<11.09-2=9.09的條件下是以離子狀態(tài)N+H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羥基呈Si-O-離子態(tài)的情況下，N+H(CH2CH3)3容易與Si-O-形成相對較強的靜電吸引力。

加入三乙胺改善峰形的時候，有兩點需要注意：
1)三乙胺的堿性很強，加入三乙胺后流動相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對色譜柱造成損傷。pH的改變也會導致出峰時間的顯著變化，可能引起的其它問題，建議流動相中加入三乙胺后回調至未加入前的pH值。通常即使pH回調過后，由于三乙胺成為了固定相的一部分，保留時間也有較大變化;

2)三乙胺在210nm處有比較強的吸收，如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時需要謹慎使用。

四烷基季銨鹽(如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后，也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結構N+(CH2CH2CH2CH3)4 ，這種結構也能有效的與Si-O-產(chǎn)生較強的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個不同于三乙胺的顯著特點是，它在低波長范圍的吸收比三乙胺弱。

流動相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑也能很好的改善峰形，其作用機理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同，是通過與樣品分子的作用來阻止樣品分子與硅羥基的作用來改善峰形。

峰前延

峰前延發(fā)生的概率比較小，下面是三種前拖峰的表現(xiàn)形式：

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造成前延峰的原因有多種，我們可依次逐一排查：
1)樣品是否過載
降低進樣濃度，看峰形是否有所改善。一般認為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。

2) 檢查是否是用流動相溶解樣品
溶解樣品的溶劑(如純甲醇)洗脫能力比流動相強會發(fā)生峰前延。
具體機理是：正常的峰形應該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個通過色譜柱柱床的過程中任何時候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進樣后到達色譜柱時間很短，應還未被流動相充分稀釋，洗脫能力更強的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導致峰前延。

3)增加流動相中緩沖鹽的濃度

增加緩沖鹽濃度可以增大流動相中的離子強度，減少因靜電的作用(有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間)引起的前延。例如：注射用苦參堿的測定

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往流動相中加入少量的四氫呋喃有時可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以內即可，需要的時候可以加入更大的量。

4)升高柱溫
升溫有助于增加流動相傳質速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對試劑的時候，最好不要超過40度。

柱頭污染和柱頭塌陷都會造成裂峰，最常見的原因是篩板上顆粒物堵塞樣品進入色譜柱不均一，只需反沖色譜柱將顆粒物除掉就可解決。

分保留時間重現(xiàn)性和保留時間單向漂移兩類

1. 保留時間的重現(xiàn)性
在色譜分析中最重要的是分離選擇性，保留時間的重現(xiàn)性則是可簡單通過用峰面積定量代替峰高定量來消除其對分析結果的影響。溫度、流動相組成、pH、離子強度等的微小變化都會引起保留時間的改變。10-20柱體積流動相平衡是必須的。三乙胺等添加劑加入，平衡時間需加長。
固定相流失：

1) 在酸性條件下鍵合相碳鏈水解斷裂流失;
2)堿性條件下硅膠基質溶解導致在基質上鍵合固定相流失;
3)pH2-8下，上述兩種因素導致的流失仍會緩慢發(fā)生。多位鍵合比單點鍵合好，長鏈比短鏈鍵合牢固，用于封尾的鍵合相易流失;C18鏈的穩(wěn)定性比CN基鏈大三個數(shù)量級，一個是3個月會有明顯流失，一個是1小時;用有機相洗柱子會加快流動相的流失。
柱污染：污染物作為固定相的一部分起保留作用，隨著污染程度的逐步增加，保留時間發(fā)生趨向性的變化。
流動相組成變化: 如甲醇等揮發(fā)引起保留時間逐步變大。
相塌陷：純水條件下，C18柱會發(fā)生固定相塌陷，引起保留時間逐步變小甚至失去保留能力。

2. 柱與柱之間的重現(xiàn)性
同一批填料生產(chǎn)出的不同柱子，裝柱密度或柱體積的不同引起保留時間不一致。同樣尺寸規(guī)格柱子，填料裝得越結實，柱體積越小，保留時間越快。正常情況只有百分之幾的差別。
平衡程度、老化程度、使用歷史及污染程度的不一樣都會導致兩根同品牌同批次色譜柱之間的保留時間不一致。

3. 批與批之間的重現(xiàn)性
由于不同批次填料之間的差異性導致。主要是表面鍵合度(可用載碳量指標)和羥基活性方面的差異?？烧{整方法提高方法的適應性，或者讓廠商備存足夠的同批次的適應方法的填料。

色譜柱如果得到正確使用、維護和保養(yǎng)，壽命會很長。在使用保護柱的情況下，有壽命超過1萬針的實例。如果不用保護柱，即便得到很好保養(yǎng)維護，一般能用到2000針左右就不錯了。不過保護柱頻繁換柱芯的成本也不低，而且使用裝填不好的保護柱還會影響分離質量。
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對硅膠基質色譜柱，流動相p H值和樣品清潔程度對壽命影響較大。個人認為高柱溫對壽命有影響，但不大，即使方法要求70攝氏的柱溫，也沒發(fā)現(xiàn)有顯著的壽命縮短。進針前樣品處理得越干凈，色譜柱壽命當然越長。但樣品前處理也是需要花錢的，需要在前處理成本、色譜柱成本和數(shù)據(jù)質量之間進行權衡。

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色譜柱是高檔儀器中的高檔部件，表面看，一支只有和筷子一樣大小的色譜柱，2000-5000元價格算比較昂貴了，但色譜柱的使用成本占整個分析成本的比例卻很低。因為色譜柱是耗材中可重復試用次數(shù)算多的，按平均用2000次計算，單次使用成本僅有1-2元人民幣，與制樣和試劑成本相比，幾乎可忽略不計。制樣用的SPE萃取小柱，過濾樣品和流動相的濾膜，一次性用完之后，我們眼都不眨就扔掉了。因此，盡管通過本文中提到的很多再生清洗方法能延長使用壽命，但還需要權衡是否值得花時間這樣做，一是清洗色譜柱用的試劑是需要成本的，二是再生修復的柱子畢竟不能完全恢復到新柱的性能，三是繼續(xù)使用性能已經(jīng)下降很多的色譜柱，萬一造成分析項目失敗，得不償失。建議每支色譜柱固定做一種分析方法。盡管一開始需要備的色譜柱多一些，但從長期來看，這樣做和用一根色譜柱來回切換用于不同的樣品分析相比，產(chǎn)生問題會更少，色譜柱花費的總體成本會更低。

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