如何解決峰拖尾與峰前延？

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峰形對(duì)稱性的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。色譜實(shí)踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對(duì)峰形有很大影響。
引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個(gè)特點(diǎn)：對(duì)先出的峰影響大，對(duì)后出峰影響??；柱頭塌陷、柱頭和篩板污染會(huì)引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級(jí)保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會(huì)造成峰拖尾。

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峰拖尾常見的3種拖尾情況：

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次級(jí)保留引起峰拖尾的機(jī)理解析：

反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對(duì)極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級(jí)保留效應(yīng)。

反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5～4.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動(dòng)相的pH-pKa>2即pH>6.7時(shí)，99%以上的硅羥基應(yīng)該是呈離子狀態(tài)的，即Si-O- ，而pKa-pH>2即pH<2.5時(shí)，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99%以上的硅羥基應(yīng)該是呈分子狀態(tài)的，即Si-OH，但其極性依舊存在，即Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對(duì)于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強(qiáng)得多。同時(shí)，因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長(zhǎng)鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會(huì)不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。

完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應(yīng)的僅達(dá)2～3.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應(yīng)，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個(gè)惰性基團(tuán)。三甲基硅烷還是比氫原子大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。

相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機(jī)會(huì)，獲得良好的峰形。

解決方案：
1)先檢查樣品是否過載

由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進(jìn)樣量(包括進(jìn)樣體積或濃度)，進(jìn)樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測(cè)定：

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2)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH
將流動(dòng)相的pH調(diào)至比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測(cè)物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測(cè)定：

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堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH< 8.64的時(shí)候它是完全呈離子態(tài)的， 那么pH在2.5~8.64時(shí)，特別是pH6.7～8.64時(shí)，此時(shí)甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)-NH3+和Si-O-形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導(dǎo)致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林(含-N(CH3)2，堿性比-NH2強(qiáng))在pH 7.0的條件下來評(píng)價(jià)和比較不同色譜柱之間的優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH<2.5的條件下，也依舊后拖，是因?yàn)?NH3+足夠強(qiáng)，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與Si-Oδ-Hδ+中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。當(dāng)pH>12.64，大于pKa2以上時(shí)，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會(huì)引起拖尾。

3)增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度
流動(dòng)相中加入緩沖鹽，增強(qiáng)了流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，在-NH3+等極性基團(tuán)和硅羥基Si-O-之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機(jī)會(huì)，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱(如氨基的N原子與強(qiáng)吸電子基相連)，或堿性很強(qiáng)，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被C18長(zhǎng)鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測(cè)定：

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4)加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等
拖尾的產(chǎn)生是因?yàn)?NH2、-NHR、-NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應(yīng)該有兩種，一種是占據(jù)硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)，另一種是占據(jù)-NH2、-NHR、-NR2這個(gè)作用位點(diǎn)。

在流動(dòng)相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH<11.09-2=9.09的條件下是以離子狀態(tài)N+H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羥基呈Si-O-離子態(tài)的情況下，N+H(CH2CH3)3容易與Si-O-形成相對(duì)較強(qiáng)的靜電吸引力。

加入三乙胺改善峰形的時(shí)候，有兩點(diǎn)需要注意：
1)三乙胺的堿性很強(qiáng)，加入三乙胺后流動(dòng)相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對(duì)色譜柱造成損傷。pH的改變也會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間的顯著變化，可能引起的其它問題，建議流動(dòng)相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。通常即使pH回調(diào)過后，由于三乙胺成為了固定相的一部分，保留時(shí)間也有較大變化;

2)三乙胺在210nm處有比較強(qiáng)的吸收，如果液相方法中檢測(cè)波長(zhǎng)在210nm以下測(cè)定時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。

四烷基季銨鹽(如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后，也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N+(CH2CH2CH2CH3)4 ，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si-O-產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個(gè)不同于三乙胺的顯著特點(diǎn)是，它在低波長(zhǎng)范圍的吸收比三乙胺弱。

流動(dòng)相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對(duì)試劑也能很好的改善峰形，其作用機(jī)理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同，是通過與樣品分子的作用來阻止樣品分子與硅羥基的作用來改善峰形。


峰前延

峰前延發(fā)生的概率比較小，下面是三種前拖峰的表現(xiàn)形式：

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造成前延峰的原因有多種，我們可依次逐一排查：
1)樣品是否過載
降低進(jìn)樣濃度，看峰形是否有所改善。一般認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。

2) 檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣品
溶解樣品的溶劑(如純甲醇)洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)會(huì)發(fā)生峰前延。
具體機(jī)理是：正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個(gè)通過色譜柱柱床的過程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進(jìn)樣后到達(dá)色譜柱時(shí)間很短，應(yīng)還未被流動(dòng)相充分稀釋，洗脫能力更強(qiáng)的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導(dǎo)致峰前延。

3)增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度

增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用(有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間)引起的前延。例如：注射用苦參堿的測(cè)定

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往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃有時(shí)可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以內(nèi)即可，需要的時(shí)候可以加入更大的量。

4)升高柱溫
升溫有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對(duì)試劑的時(shí)候，最好不要超過40度。

柱頭污染和柱頭塌陷都會(huì)造成裂峰，最常見的原因是篩板上顆粒物堵塞樣品進(jìn)入色譜柱不均一，只需反沖色譜柱將顆粒物除掉就可解決。


分保留時(shí)間重現(xiàn)性和保留時(shí)間單向漂移兩類

1. 保留時(shí)間的重現(xiàn)性
在色譜分析中最重要的是分離選擇性，保留時(shí)間的重現(xiàn)性則是可簡(jiǎn)單通過用峰面積定量代替峰高定量來消除其對(duì)分析結(jié)果的影響。溫度、流動(dòng)相組成、pH、離子強(qiáng)度等的微小變化都會(huì)引起保留時(shí)間的改變。10-20柱體積流動(dòng)相平衡是必須的。三乙胺等添加劑加入，平衡時(shí)間需加長(zhǎng)。
固定相流失：

1) 在酸性條件下鍵合相碳鏈水解斷裂流失;
2)堿性條件下硅膠基質(zhì)溶解導(dǎo)致在基質(zhì)上鍵合固定相流失;
3)pH2-8下，上述兩種因素導(dǎo)致的流失仍會(huì)緩慢發(fā)生。多位鍵合比單點(diǎn)鍵合好，長(zhǎng)鏈比短鏈鍵合牢固，用于封尾的鍵合相易流失;C18鏈的穩(wěn)定性比CN基鏈大三個(gè)數(shù)量級(jí)，一個(gè)是3個(gè)月會(huì)有明顯流失，一個(gè)是1小時(shí);用有機(jī)相洗柱子會(huì)加快流動(dòng)相的流失。
柱污染：污染物作為固定相的一部分起保留作用，隨著污染程度的逐步增加，保留時(shí)間發(fā)生趨向性的變化。
流動(dòng)相組成變化: 如甲醇等揮發(fā)引起保留時(shí)間逐步變大。
相塌陷：純水條件下，C18柱會(huì)發(fā)生固定相塌陷，引起保留時(shí)間逐步變小甚至失去保留能力。

2. 柱與柱之間的重現(xiàn)性
同一批填料生產(chǎn)出的不同柱子，裝柱密度或柱體積的不同引起保留時(shí)間不一致。同樣尺寸規(guī)格柱子，填料裝得越結(jié)實(shí)，柱體積越小，保留時(shí)間越快。正常情況只有百分之幾的差別。
平衡程度、老化程度、使用歷史及污染程度的不一樣都會(huì)導(dǎo)致兩根同品牌同批次色譜柱之間的保留時(shí)間不一致。

3. 批與批之間的重現(xiàn)性
由于不同批次填料之間的差異性導(dǎo)致。主要是表面鍵合度(可用載碳量指標(biāo))和羥基活性方面的差異。可調(diào)整方法提高方法的適應(yīng)性，或者讓廠商備存足夠的同批次的適應(yīng)方法的填料。

色譜柱如果得到正確使用、維護(hù)和保養(yǎng)，壽命會(huì)很長(zhǎng)。在使用保護(hù)柱的情況下，有壽命超過1萬針的實(shí)例。如果不用保護(hù)柱，即便得到很好保養(yǎng)維護(hù)，一般能用到2000針左右就不錯(cuò)了。不過保護(hù)柱頻繁換柱芯的成本也不低，而且使用裝填不好的保護(hù)柱還會(huì)影響分離質(zhì)量。
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對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱，流動(dòng)相p H值和樣品清潔程度對(duì)壽命影響較大。個(gè)人認(rèn)為高柱溫對(duì)壽命有影響，但不大，即使方法要求70攝氏的柱溫，也沒發(fā)現(xiàn)有顯著的壽命縮短。進(jìn)針前樣品處理得越干凈，色譜柱壽命當(dāng)然越長(zhǎng)。但樣品前處理也是需要花錢的，需要在前處理成本、色譜柱成本和數(shù)據(jù)質(zhì)量之間進(jìn)行權(quán)衡。

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色譜柱是高檔儀器中的高檔部件，表面看，一支只有和筷子一樣大小的色譜柱，2000-5000元價(jià)格算比較昂貴了，但色譜柱的使用成本占整個(gè)分析成本的比例卻很低。因?yàn)樯V柱是耗材中可重復(fù)試用次數(shù)算多的，按平均用2000次計(jì)算，單次使用成本僅有1-2元人民幣，與制樣和試劑成本相比，幾乎可忽略不計(jì)。制樣用的SPE萃取小柱，過濾樣品和流動(dòng)相的濾膜，一次性用完之后，我們眼都不眨就扔掉了。因此，盡管通過本文中提到的很多再生清洗方法能延長(zhǎng)使用壽命，但還需要權(quán)衡是否值得花時(shí)間這樣做，一是清洗色譜柱用的試劑是需要成本的，二是再生修復(fù)的柱子畢竟不能完全恢復(fù)到新柱的性能，三是繼續(xù)使用性能已經(jīng)下降很多的色譜柱，萬一造成分析項(xiàng)目失敗，得不償失。建議每支色譜柱固定做一種分析方法。盡管一開始需要備的色譜柱多一些，但從長(zhǎng)期來看，這樣做和用一根色譜柱來回切換用于不同的樣品分析相比，產(chǎn)生問題會(huì)更少，色譜柱花費(fèi)的總體成本會(huì)更低。




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